4．烤片：60℃ 30分鐘或37℃ 過夜，溫度太高或時間太長，抗原容易丟失。

5．蠟塊及切片的保存：在4℃保存

6．脫片問題： Poly-L-Lysine（多聚賴氨酸）為目前免疫組化染色工作中zui常用的一種防脫片劑，6ml的多聚賴氨酸溶液可按1:10稀釋成60ml的工作液，適合于需要酶消化、微波、高溫高壓的防脫片處理。如不行，可用雙重處理（APES和Poly-L-Lysine）的切片。在以上兩種條件都行不通的情況下，可用如下方法：切片在脫蠟前，放在APES 1：50 丙酮溶液中浸泡3分鐘，晾干，即可進(jìn)行下一步。

7．滅活內(nèi)源性酶：HRP系統(tǒng)：3%雙氧水滅活；AP系統(tǒng)：3%HAc滅活。

8．暴露抗原：對于石蠟切片的免疫組化實(shí)驗(yàn)時，必須采用高溫加熱抗原修復(fù)，這將有助于暴露抗原決定簇，從而增加免疫組化染色的強(qiáng)度（不同抗體的*修復(fù)液請參閱抗體說明書）。對于不同的組織，不同的抗原，不同的抗體，所采用的方法應(yīng)不一樣，可進(jìn)行熱修復(fù)、胰酶消化、既不修復(fù)也不消化。膠原還可以用胃蛋白酶消化等。

9．封閉：在山羊血清封閉，非特異性染色仍然較強(qiáng)時，可延長封閉時間或用濃縮血清封閉

10．抗體稀釋：應(yīng)遵循“現(xiàn)用現(xiàn)配”的原則，對于PBS稀釋的抗體一定要當(dāng)天使用。

11．背景高：在抗體濃度、反應(yīng)時間、反應(yīng)溫度等合適的條件下，如果背景依舊高，可采用含1‰ Tween20的PBS洗，特別是在顯色之前要多洗。

12．返藍(lán)：在蘇木素復(fù)染后，可用堿性緩沖液（如PBS）或Na₂HPO₄的飽和溶液返藍(lán)。

13．顯色：一定要在顯微鏡下觀察，注意控制背景。

14．在整個操作過程中，切片千萬不能干燥，否則會有非特異性染色