膠原在大鼠中成功誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎方案（CIA）

膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎（CIA）應(yīng)用是用Ⅱ型膠原免疫Wistar(遠(yuǎn)親雜交)、Sprague-Dawley (遠(yuǎn)親雜交)和Wistar-Lewis (近交) 中誘導(dǎo)成功。由于此CIA模型具有與人風(fēng)濕病關(guān)節(jié)炎（RA）相同的免疫和病理特征，因此該模型先后擴(kuò)展到小鼠及非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，并已作為人類關(guān)節(jié)炎研究的廣泛應(yīng)用的模型。然而，對(duì)于CIA模型來(lái)說(shuō)，不同種屬動(dòng)物之間是有差異的。小鼠對(duì)CIA的敏感性與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）相關(guān)，在小鼠品系中只有DBA/1(H-2^q)和B10.RⅢ(H-2^r)兩個(gè)品系對(duì)CIA敏感。大鼠對(duì)CIA的敏感性也與MHC相關(guān)，并與小鼠相比具有較寬的品系范圍。因此，不同MHC型的不同品系的大鼠，盡管關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率、嚴(yán)重程度及抗體和T-cell 的特異性在不同品系間不同，但都能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。

動(dòng)物的管理與飼養(yǎng)

動(dòng)物必須是7-8 周齡健康的并在SPF條件下飼養(yǎng)的動(dòng)物。一般來(lái)說(shuō)，對(duì)于腸道菌群，不管是否致病都顯著影響宿主對(duì)抗原的免疫應(yīng)答。無(wú)菌的大鼠對(duì)佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎高度易感（AIA），其次是SPF級(jí)大鼠及一般大鼠敏感性相對(duì)較低。即使同一品系,CIA 的發(fā)病率及嚴(yán)  重程度也有顯著差異，這種差異是由于飼養(yǎng)條件造成的。

   *，小鼠的飲食影響  CIA的發(fā)病率及嚴(yán)重程度。然而在大鼠在中沒(méi)有進(jìn)行廣泛研究。與小鼠相比，大鼠對(duì)Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答更快且較短時(shí)間內(nèi)能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎，因此飲食對(duì)小鼠來(lái)可能不是影響關(guān)節(jié)炎的重要因素。然而，像小鼠一樣，飼以高脂肪的食物對(duì)誘發(fā)關(guān)節(jié)炎更有利。

大鼠的品系

對(duì)Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答以及關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展與MHCRT1位點(diǎn)相關(guān)而且用于免疫的Ⅱ型膠原的動(dòng)物來(lái)源不同也會(huì)造成大鼠對(duì)Ⅱ型膠原的免疫應(yīng)答以及關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展上的差異。然而，與小鼠相比，很多品系的大鼠對(duì)CIA敏感，并能誘發(fā)一定程度的關(guān)節(jié)炎。一般來(lái)說(shuō)，豬的Ⅱ型膠原是的致炎膠原其后是牛的二型膠原，雞的二型膠原致炎性zui差。以下大鼠品系是已明確的對(duì)CIA高度易感的品系：BB/DR (RT1^u), Wistar Furth, LOU (RT1^u), OM (RT1^u)和 LEW (RT11) 大鼠。

  動(dòng)物質(zhì)量也很重要。在這方面，腸道菌群可能是影響機(jī)體對(duì)二型膠原免疫應(yīng)答和關(guān)節(jié)炎進(jìn)展的重要影響因素之一。例如:Lewis 大鼠對(duì)CIA高度易感，同時(shí)發(fā)病率和炎癥嚴(yán)重程度都很高。但是同是SPF級(jí)Lewis 大鼠對(duì)CIA的敏感性由于年齡、飼養(yǎng)條件及免疫腸道菌而對(duì)CIA的敏感性存在顯著差異。MDP(胞壁酰二肽)對(duì)加強(qiáng)Lewis 大鼠對(duì)CIA的發(fā)病率和嚴(yán)重程度非常有效。但是我們建議在用Lesis 大鼠造模之前先進(jìn)行小規(guī)模試驗(yàn)，據(jù)我們所知BB大鼠是用于CIA造模的品系。

DA大鼠對(duì)CIA的敏感，但是同時(shí)AIA（佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎）及礦物油誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（僅礦物油）高度敏感，因此不推薦用于CIA的造模。

 注1：與小鼠相反大鼠對(duì)同源（大鼠）Ⅱ型膠原是敏感的，同時(shí)誘發(fā)和猴一樣的關(guān)節(jié)炎。

 注2：與小鼠和猴子相反，大鼠對(duì)Ⅱ型膠原抗體是針對(duì)Ⅱ型膠原分子構(gòu)象的特異性抗體。因此膠原變性或免疫Ⅱ型膠原的單獨(dú)CB肽段都不能在大鼠中致炎。

膠原

因?yàn)槿ヌ腔哪z原會(huì)影響關(guān)節(jié)炎的產(chǎn)生，同時(shí)一些未去除的雜質(zhì)比如：胃蛋白酶可能會(huì)導(dǎo)致T細(xì)胞刺激試驗(yàn)中產(chǎn)生假陽(yáng)性，因此Ⅱ型膠原應(yīng)按規(guī)定高度純化。如果按恰當(dāng)?shù)姆椒▋龈傻哪z原-20℃避光保存的條件下，是非常穩(wěn)定的。純化的膠原溶于0.05M濃度的醋酸中，終濃度為2-4mg/mL，溫和攪拌，4℃過(guò)夜。膠原溶液在4℃保存一周，此后需在-20℃保存。Chondrex 公司提供較完整的不同免疫級(jí)別的Ⅱ型膠原。（見(jiàn)表1）

表1 不同種屬來(lái)源Ⅱ型膠原

乳劑的制備

1）由于大鼠通常對(duì)佐劑誘發(fā)的關(guān)節(jié)炎（AIA）是敏感的，因此必須使用不*佐劑（IFA）,貨號(hào)是7002。乳劑的質(zhì)量是能否誘發(fā)關(guān)節(jié)炎高發(fā)病率的關(guān)鍵因素。乳劑的制備有多種方法。但是不推薦注射器或超聲波處理的方法。這些方法將導(dǎo)致乳劑不能夠有效的、穩(wěn)定的誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。此外，超聲波處理方法，至少將膠原分成2個(gè)片段，這些小片段在正常體溫下，很容易變性。推薦使用電動(dòng)的高速攪拌器：

用高速攪拌器（帶直徑≤5mm的刀片，Fig.1）攪拌不*佐劑（IFA）和膠原溶液(Fig 2a)。如果刀片夠不到注射器低端，可以把5mL或10mL的注射器從活塞處剪去一半（Fig.2b）。把注射器夾緊，固定在鐵架臺(tái)上，并冰浴。zui后一步很重要，因在攪拌過(guò)程中會(huì)發(fā)熱，會(huì)引起蛋白變性，變性的蛋白不能夠誘發(fā)關(guān)節(jié)炎（CIA）。

   Fig1. 高速攪拌器Fig2  刀片，截?cái)嗟淖⑸淦?，漢密爾頓玻璃注射器、

Fig. 截?cái)嗟淖⑸淦鳎Ъ苌瞎潭?，冰?/span>

2）加1體積（zui多2.5mL）不**佐劑到注射器，再加等體積的膠原溶液（0.05M醋酸溶解的的膠原溶液，終濃度2mg/mL），邊低速攪拌邊滴入膠原溶液。

３）繼續(xù)混合，直到在zui大轉(zhuǎn)速產(chǎn)生穩(wěn)定的乳液（轉(zhuǎn)速約３0０００rpm/2-3 min）。在再次混合前確保乳液是冰浴中。對(duì)于大體積（2-5Ml）為了使乳液混合均勻，建議在混勻過(guò)程中移動(dòng)攪拌位置。

 注：可能需重復(fù)攪拌2-3次

4)將一滴乳劑滴與一燒杯水中，檢測(cè)乳劑的穩(wěn)定性。如果乳劑是穩(wěn)定的，在水中是成團(tuán)的，不散開(kāi)。

   注：如果乳劑在水面散開(kāi)，表明乳劑不穩(wěn)定。再加幾滴佐劑，重新混合后，再檢測(cè)。

5）將乳劑轉(zhuǎn)移到1mL Hamiton 玻璃注射器。不加建議采用塑料注射器，因?yàn)楹茈y做到一個(gè)準(zhǔn)確的注射劑量。

注1：通過(guò)用力甩注射器將乳劑中的氣泡趕出注射器（活塞部向下）。否則很難做到一個(gè)的注射劑量。

注2：建議在乳劑制備好的一小時(shí)內(nèi)，注射完畢。乳劑在在用前一直保持4℃。

注射部位

在鼠尾根部注射0.2mL(膠原：200μg)乳劑（Fig.4）。例如：從尾根部2cm處插入針頭，直到針尖插入位置距尾根部0.5cm。針插入皮下且每次注射充分擦拭，防止乳液的露出。針頭沿斜向上與鼠尾方向平行插入。如果要加強(qiáng)免疫，注射部位在尾根部3Cm處，針尖插入皮下?lián)笪哺?/span>1.5cm處。

注1：背部皮下注射也非常有效，但需注射更多的膠原乳劑（0.5-1Ml）。

注2：無(wú)論如何，我們不建議背部皮下注射或腹腔注射膠原乳劑和佐劑，如初次免疫或加強(qiáng)免疫。因?yàn)椴?佐劑在腹膜和腹腔引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

圖4：皮下免疫乳劑

免疫程序

Ⅱ型膠原的自身IgG抗體水平及其亞型（可激活補(bǔ)體），對(duì)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生很重要。依據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康挠泻芏喾N方法可誘發(fā)高發(fā)病率的關(guān)節(jié)炎。

1. 通過(guò)單次免疫（無(wú)加強(qiáng)免疫）誘發(fā)關(guān)節(jié)炎

 依據(jù)說(shuō)明書方法制備乳劑（膠原-不*佐劑）和免疫，由于不同品系的的敏感性的差異，一般在2-3周可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。在一些免疫應(yīng)答較強(qiáng)的品系，發(fā)病率達(dá)到80-90%。對(duì)于一些高度易感品系如BB大鼠，關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度，臨床評(píng)分可達(dá)到10-12分（zui高16分）。

b 通過(guò)加強(qiáng)免疫誘發(fā)關(guān)節(jié)炎

  為了確保關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率和嚴(yán)重度，可在初次免疫7天后加強(qiáng)免疫。按說(shuō)明書方法，準(zhǔn)備膠原-不*佐劑，尾部皮下注射0.1mL,會(huì)短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎。

  按要求制備膠原+IFA 乳劑（1：1）

  初次免疫(0day) ：200 ul 乳劑/只

  加強(qiáng)免疫（7day）：100ul 乳劑/只

c 用人工合成的胞壁酰二肽作為佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎

  *弗氏佐劑含滅活的結(jié)核桿菌，不能和二型膠原合用免疫大鼠。但是，可以用另一種佐劑MDP(N-acetylmuramyl-alanyl-D-isoglutamine hydrate)  用于免疫。用雙蒸水溶解MDP至4-8mg/ mL。 膠原溶解于0.5M的醋酸中，終濃度為4mg/ mL。免疫前等體積混合MDP和膠原溶液。將MDP-膠原混合物和等體積的IFA(不*佐劑)按上述方法混合。尾部皮下注射0.2 mL。與僅使用不*佐劑相比，這種方法在關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率、嚴(yán)重性和一致性（實(shí)驗(yàn)批間）都會(huì)大大提高。

注：?jiǎn)为?dú)使用高劑量（0.8mg/只）的MDP也能誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。因此，建議依據(jù)不同品系，優(yōu)化使用MDP劑量。不要在DA大鼠使用這種方法。

關(guān)節(jié)炎的發(fā)生

于小鼠相比（約4周），關(guān)節(jié)炎在大鼠中產(chǎn)生的更快，初次免疫后，2-3周出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫脹。在BB大鼠發(fā)生關(guān)節(jié)炎的時(shí)間比其它品系更快，約12-14天。如果免疫有效，3周后100%發(fā)生關(guān)節(jié)炎。

臨床評(píng)分

關(guān)節(jié)炎可通過(guò)臨床評(píng)分來(lái)定性評(píng)估或用測(cè)厚儀來(lái)測(cè)量爪子厚度來(lái)評(píng)估。這些方法適用于所有的關(guān)節(jié)炎模型比如經(jīng)典的CIA，佐劑誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎和棉線誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎。

表2  關(guān)節(jié)炎炎癥程度的臨床評(píng)分