產(chǎn)品描述

Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit）是用FITC或PE標記了的Annexin V作為探針，來檢測細胞早期凋亡的發(fā)生，可用熒光顯微鏡、流式細胞儀或其他熒光檢測設(shè)備進行檢測。

其檢測原理為：在正常的活細胞中，磷脂酰絲氨酸（phosphotidylserine，PS）位于細胞膜的內(nèi)側(cè)，但在早期凋亡的細胞中，PS 從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面，暴露在細胞外環(huán)境中。Annexin-Ⅴ（膜聯(lián)蛋白-V）是一種分子量為35-36KD的Ca²⁺ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力結(jié)合。可通過細胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結(jié)合。

另外，試劑盒中還提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）和7AAD用來區(qū)分存活的早期細胞和壞死或晚期凋亡細胞。PI和7AAD為核酸染料，不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整的細胞膜，但可以透過凋亡晚期和壞死細胞的細胞膜而使細胞核染紅。因此，將Annexin V與PI或7AAD聯(lián)合使用時，PI和7AAD 則被排除在活細胞（Annexin V-/PI- or 7AAD-）和早期凋亡細胞（Annexin V+/PI- or 7AAD-）之外，而晚期凋亡細胞和壞死細胞同時被FITC 和PI或PE 和7AAD 結(jié)合染色呈現(xiàn)雙陽性（Annexin V+/PI+ or 7AAD+）。

產(chǎn)品組分

·         運輸與保存方法

·             冰袋（wet ice）運輸。本試劑盒中所有組分均在4℃保存，Annexin V-FITC、PI需避光保存。長期不用可將Annexin V-FITC放到-20 ºC保存。

·         使用說明

·         1.1 細胞樣品制備

·           1.a) 懸浮細胞：在進行完細胞凋亡刺激后，1000g，4℃離心5 min收集細胞。
b) 貼壁細胞：把細胞培養(yǎng)液吸出至一合適離心管內(nèi)（內(nèi)含已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細胞），PBS洗滌貼壁細胞一次，加入適量胰酶（不含EDTA）消化細胞。室溫孵育至輕輕吹打可以使細胞發(fā)生吹打下來時，吸除胰酶，避免胰酶消化不夠或消化過度。加入收集的細胞培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1000g，4℃離心5 min。
注意：1）中期凋亡細胞因失去貼壁能力而懸浮于上清中，此部分細胞對于結(jié)果是否顯著具有重大影響，不可任意丟棄，需離心收集后一起檢測才能全面反映出細胞凋亡的整體情況；
2）胰酶消化時細胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。

·           2.棄上清，用預(yù)冷的1ml PBS輕輕重懸細胞并計數(shù)（細胞數(shù)量不少于10⁵），1000g，4℃離心5 min。收集細胞。
注意：PBS洗掉殘留的胰酶，否則殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，zui終導(dǎo)致染色失敗。

·           3.加入400μl 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞。

·           4.加入5μl Annexin V-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育15分鐘。

·           5.加入10μl PI染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置5 min。

·           6.在30分鐘內(nèi)進行流式細胞儀檢測，Annexin V-FITC為綠色熒光，PI為紅色熒光。

·         1.2 樣品分析

·         A．流式細胞儀分析：

·         FITC的綠色熒光激發(fā)波長為488 nm，建議在FL1通道檢測；PI的紅色熒光在FL2通道檢測。用CellQuest等軟件進行分析，繪制雙色散點圖（two-color dot plot），F(xiàn)L1為橫坐標，F(xiàn)L2為縱坐標。每個樣采集10000 events。典型的實驗中，細胞可以分成三個亞群，活細胞僅有很低強度的背景熒光，早期凋亡細胞僅有較強的綠色熒光，晚期凋亡細胞有綠色和紅色熒光雙重染色。

·         使用流式細胞儀正確分析Annexin V-FITC/PI雙染的細胞前要求儀器的熒光補償來去除兩種染料激發(fā)光之間的疊加，不同儀器之間的補償不同。因此需要設(shè)置未處理的空白細胞和經(jīng)Annexin V-FITC、PI分別單染的細胞來調(diào)整熒光補償去除光譜重疊。

·         B．熒光顯微鏡分析：

·         1000g，4℃離心5 min，收集細胞，用50-100μl 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞，涂片后，在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

·         注意事項

·           1.該試劑盒只能檢測活細胞，而不能用于切片、擦刮、固定或浸潤細胞樣品的檢測。

·           2.由于細胞凋亡是一個快速的過程，建議樣品在染色后盡快檢測。

·           3.如果有細菌或真菌污染，會嚴重影響檢測效果。

·           4.PBS洗滌細胞，洗掉殘留的胰酶，否則殘留的胰酶會消化并降解Annexin V-FITC，zui終導(dǎo)致染色失敗。

·           5.熒光物質(zhì)均易發(fā)生淬滅，在進行熒光觀察時，盡量縮短觀察時間，同時在操作和存放過程中也盡量注意避光保存。

·           6.如果樣品來源于血液，請務(wù)必除去血液中的血小板。因為血小板含有PS，能與Annexin V結(jié)合，從而干擾實驗結(jié)果?？梢允褂煤蠩DTA的緩沖劑并在200 g離心洗去血小板。

·           7.試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

·           8.Annexin V-FITC和PI是光敏物質(zhì)，在操作時請注意避光。

·           9.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。